调节外泌体膜胆固醇含量实现基于膜融合机制的siRNA胞质递送
外泌体的细胞摄取主要依赖于内吞作用机制和内溶酶体捕获，其递送的siRNA在酸性和酶促环境中极易降解，导致递送效率偏低。近期发表于Nature Nanotechnology期刊的研究证明，增加外泌体膜中胆固醇含量可以使其通过膜融合机制被细胞摄取，可以规避上述siRNA降解现象，提高递送效率。
【不同胆固醇含量外泌体的制备及理化表征】
天然牛奶外泌体中胆固醇含量约为18%（w%），该研究一方面使用甲基-β-环糊精（MeβCD）去除牛奶外泌体膜中的胆固醇（Chol）以降低其含量（见上图），另一方面通过薄膜水合方法在牛奶外泌体膜中加入胆固醇以提高其含量，最终得到胆固醇含量分别为5%、10%、18%、23%和30%的工程化外泌体(以X%Chol/MEs表示，如下图)。所有工程化外泌体的粒径约为140 nm，ζ电位约为-12 mV。透射电镜显示随着外泌体膜胆固醇含量的增加，外泌体杯状形态逐渐模糊，脂膜增厚。冷冻电镜结果显示，所有工程化外泌体均呈球形且粒径单分散性良好。工程化外泌体的弹性与膜内胆固醇含量直接相关，随着膜中胆固醇含量的增加，其刚性显著降低。分子动力学模拟显示，高胆固醇的外泌体膜会发生变形，增加其与细胞膜的接触面积，最终促进膜融合发生。
【高胆固醇外泌体的细胞摄取机制】
外泌体的细胞摄取实验结果表明，随着膜胆固醇含量的增加，结直肠癌细胞HCT116对牛奶外泌体的摄取能力增加，其中30%Chol/MEs外泌体的摄取量分别是5%Chol/MEs、10%Chol/MEs、18%Chol/MEs和23%Chol/MEs 外泌体的4倍、3.5倍、2倍和1.6倍。激光共聚焦显微镜观察结果显示，30%Chol/MEs可以与HCT116癌细胞膜融合，而天然外泌体和脱胆固醇外泌体组未发现此现象。其中，5%Chol/MEs外泌体先附着在细胞膜上，然后被囊泡包裹，最终通过经典内吞作用被运输到细胞质中。上述结果表明，高胆固醇外泌体的细胞摄取主要依赖于膜融合机制。
【高胆固醇外泌体的siRNA递送和基因沉默效果】
以30%Chol/MEs外泌体递送Cy3荧光标记的siRNA发现，只有少量siRNA与溶酶体存在共定位，而与内质网有清晰的共定位，表明其多数未被溶酶体捕获。相比之下，5%Chol/MEs外泌体递送的siRNA大部分与溶酶体存在共定位，极少数siRNA与内质网共定位。上述结果进一步证明，30%Chol/MEs外泌体主要通过膜融合机制被细胞摄取，siRNA不经过溶酶体可以直接释至细胞质中，使其能够到达内质网以发挥功能。以PLK1-siRNA作为递送药物评价工程化外泌体对HCT116细胞中靶基因的沉默效率，结果显示30%Chol/siPLK1外泌体组对PLK1 mRNA下调达到84.1%，PLK1蛋白水平下调约60%，且表现出显著的增殖抑制和凋亡效应。基于上述结果，研究人员认为30%Chol工程化外泌体的递送性能优于市售的转染试剂Lipofectamine 2000和RNAiMAX等。
【高胆固醇外泌体递送siRNA的抗肿瘤效果】
异位结直肠癌移植瘤模型的静脉注射治疗实验表明，PBS对照组小鼠肿瘤体积分别是30%Chol/siPLK1、18%Chol/siPLK1和5%Chol/siPLK1外泌体治疗组的7.3倍、4.1倍和2.8倍，30%Chol/siPLK1组几乎完全抑制了肿瘤生长。原位结直肠癌小鼠模型的口服给药治疗实验表明，Cy5.5标记的siRNA与荧光素酶标记的肿瘤细胞具有显著的共定位，表明工程化外泌体在口服给药后24小时内可以聚集在结肠并被结直肠癌细胞摄取。小鼠每天以100微克/公斤的给药标准口服含siPLK1的工程化外泌体连续14天，治疗期间小鼠体重无显著变化，主要器官没有观察到显著组织毒性，生物相容性良好。肿瘤生长监测显示(下图），5%Chol/siPLK1（G1）和18%Chol/siPLK1（G2）治疗组显著抑制了肿瘤生长。30%Chol/siPLK1（G3）治疗组肿瘤出现回缩，显示出最强的抗肿瘤效果。
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